PCR引物设计

先到NCBIgene网站搜索所需的引物的gene id，然后primerbank找不同的转录本，防止mRNA不同引起功能不同。

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/

for example, HP_0939, HP_0497, HP_0471

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/899468

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000915.1?from=999607&to=1000320&report=fasta&strand=true

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/899258

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000915.1?from=522742&to=524070&report=fasta

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/899250

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000915.1?from=492809&to=494059&report=fasta&strand=true

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=85962

Helicobacter pylori 26695
equivalent:
Helicobacter pylori (strain 26695)
Helicobacter pylori strain 26695
NCBI BLAST name: e-proteobacteria
Rank: strain
Genetic code: Translation table 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)
Other names:
heterotypic synonym
Helicobacter pylori ATCC 700392
equivalent:
Helicobacter pylori str. 26695
heterotypic synonym
Helicobacter pylori KE26695

HP共有3350基因

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=txid85962[Organism:noexp]

找到引物以后到DNAman或者blast验证

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/

http://genome-asia.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?hgsid=588548721_aAaWQaTDLQNtAsm4V54nSYD0lFqA&redirect=manual&source=genome.ucsc.edu

http://www.keyangou.com/article/73 部分通用引物

引物设计原则
引物长度（primer length）

产物长度（product length）

序列Tm值 (melting temperature)

G+C含量（composition）

引物二聚体及发夹结构

（duplex formation and hairpin）

阅读框

数据库检索：

NCBI: PubMed, Gene, Genome, Protein

EBI: Ensembl

GeneCards

UCSC

引物设计

Primer 3

In Silico PCR(UCSC)

Blat(UCSC) and Blast(NCBI)

核酸序列分析

Reverse Completment

Webcutter

Blast(NCBI)

ClustalW

蛋白质序列分析

ExPASy: UniProtKB, Translate,ProParam

TMHMM

其他网络资源
NCBI 美国国立生物信息中心

 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

EBI 欧洲生物信息研究所

 http://www.ebi.ac.uk/

GeneCards 以色列生物信息中心

http://www.genecards.org/index.shtml

UCSC 加利福尼亚大学圣克鲁斯分校

http://genome.ucsc.edu/

2014-05-14 10:33
NCBI参考序列(RefSeq)：一个精选非冗余基因组，转录组和蛋白质序列数据库

NCBI的参考序列(RefSeq)数据库( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq )
是表征基因组，转录组和蛋白质的序列的一个精选的非冗余收集。该数据库包括3774种生物，跨越了原核生物，真核生物和病毒，并具有2,879,860条蛋白质记录(RefSeq发布19)。RefSeq记录整合了来自多种来源的信息，考虑到额外的信息可从那些来源中获得，因此代表了序列和其特征的当前描述。注释包括编码区，保守区，tRNAs，序列标签位点(sequence tagged sites，STS)，变异，参考，基因和蛋白质产物名字，及数据库交叉引用。使用一种组合的合作方式和来自科学家，预测，来自GenBank的传播和NCBI工作人员的精选的其他输入，序列被审查，并且特征被添加。所有的RefSeq记录的格式被确认，并且越来越多数目的测试正在被应用于评估序列和注释的质量，特别是在完整基因组序列背景下。

不知不觉几年下来自己也快毕业了，感谢丁香园这些年来的帮助。没有什么可回报的东西，就发个帖教教新人如何设计引物吧，尽量做到手把手的教，图文并茂。

引物设计的帖子不少，以前很多战友会推荐Oligo、PrimerPremier、DNA man等等软件。这些软件设计完最后还是要去BLAST比对下，所以我教大家一种易懂实用的在线设计方法，觉得好的话请投个票。

就以人的PTEN基因为例，首先你要找到他的基因序列，如果你要用的是cDNA，就找它的mRNA序列。如果你要做的是DNA，就找DNA的序列。

以cDNA为例，普遍的一种方法是上PUBMED中GENE栏搜索找到cDNA那栏，但PUBMED导出序列不太方便，我介绍个网站 http://asia.ensembl.org/index.html

输入目的基因，进入

2.在左侧栏选择TRANSCRIPT，选择后进入

选择PTEN-001中的TRANSCRIPT进入，点击左侧cDNA

然后点击CONFIGURE THIS PAGE进入设置你要显示的内容

除了第一栏SHOWEXONS选择YES外，其他的都选择NO，然后取个名字保存SAVE CONFIGURATION AS

然后在左侧栏点击DOWNLOADVIEW AS RTF可下载你要的cDNA序列，这个文件可以用WORD打开，不同的颜色代表一个外显子间断

下载后打开的WORD

然后根据可以根据你感兴趣的序列设计引物了，比如我在分别在第6和第7外显子分别设计上下游引物。选取并复制第6和第7外显子序列

登陆 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
，粘贴这段序列，设置好RANGE和PCR产物的大小，然后在下面点击GET PRIMERS，可以在线设计并比对引物

9.最后选择一个比较特异性的引物，条带大小要尽量单一，其他的基因序列尽量不要比对到